內容

操作過程

一般技術要點說明

方法摸索優化

目標優化梯度條件，確定分析波長。

1、 樣品溶劑選擇；

2、 濾膜吸附試驗；

3、 DAD檢測器下，波長選擇主成分大吸收或平臺處。

4、 分離條件選擇；

5、 色譜柱對比；（根據情況酌定）

6、DAD檢測器下，水、1mol/l酸、堿、氧（10%雙氧水）、光照、高溫破壞，各起始物料，中間體，輔料（制劑時需同時進行空白輔料破壞）等成分分離。

1、 一般在無參考標準或標準的方法無法直接套用時,需進行此項內容，如3類藥。

2、樣品溶劑：對樣品有很好的溶解能力，實驗室自然放置穩定存放12小時以上，與流動相有良好的互溶效果。

3、續濾液峰面積達穩定大值，續濾液體積在5ml以下時較為適宜，否則需要重新篩選溶劑。

4、破壞程度10%左右（5%—15%）為宜，2mol/l酸或堿90℃水浴12小時無破壞即視為樣品穩定，不必再追求降解度。4500lx光照48小時，樣品粉末及溶液需要同時做。破壞后的樣品溶液及空白溶劑均需調整至流動相pH方可進樣，可避免對色譜柱產生影響。如果破壞過20%，需要降低破壞條件。

5、分離度良好，測定無干擾，各峰峰純度符合單峰要求。

6、梯度變化要有高洗脫能力過程，目的證明所有的雜質成分均能夠被洗脫檢測。

7、方法摸索優化實驗一般是不上資料的，只是體現在實驗記錄本中，除非是沒有方法依據時，如3類藥申報時，梯度選擇及波長選擇等均需要在資料中體現。

8、方法優化完成后，后在同一天同一人，用同一臺機器，對所有樣品進行分析測定，具有可比性。

9、方法摸索優化實驗采用工藝已經確定的實驗室小試、實驗室放大樣品進行，前期用于原料合成樣品配合檢測時，可以采用大范圍的梯度洗脫進行模糊檢測分析。

專屬性

目的為了驗證方法對目標成分檢測的區分能力及的雜質分析評價。

DAD檢測器或適宜的通用型檢測器下，水、1mol/l酸、堿、氧（10%雙氧水）、光照、高溫破壞，各起始物料，中間體，輔料，各雜質對照品等在同一天進行分析，可以作為申報資料中雜質譜的論述內容。

1、參照上述過程進行破壞樣品制備，空白及陰性樣品都要做。

2、分離度良好，測定無干擾，各峰峰純度符合單峰要求。

3、梯度要有高洗脫能力過程。

4、以前期確定的分析條件及方法，在同一天同一人，用同一臺機器，對所有樣品進行分析測定，具有可比性。

5、本部分數據進資料，佳采用生產線驗證的第1批樣品進行。

當色譜條件與有關物質檢查方法相同時，專屬性實驗數據可以共用。

出圖時主成分峰的紫外光譜圖及峰純度圖均要出圖。

檢測限

信噪比法，S/N≥3倍時的濃度為檢測限。

空白，再進對照品濃溶液（1mg/ml），在主峰相同位置處選擇空白溶劑1—2min范圍的基線積分得出峰高，按照峰高的3倍計算樣品濃度，直接用濃溶液稀釋至目標濃度附近即可，資料中體現至少3張圖（空白溶劑、濃溶液、及稀釋液）。

定量限

信噪比法，S/N≥10倍時的濃度為定量限。

按照基線峰高的10倍計算樣品濃度，直接用檢測限濃溶液稀釋至目標濃度附近即可，連續進樣6針，計算峰面積RSD<2%（可以放寬至5%），資料中體現6張圖（6張稀釋液）。與檢測限在同一天做，出圖時縱軸標尺與檢測限一致，減少審評員審圖時的信息誤導，提高審圖效率。

線性與范圍

5點或7點法，酌情設置。

個點在定量限濃度，中間點為濃度，后一個點為200%濃度（160%或180%），必須采用稀釋法，不得采用調整進樣量的方式。r>0.999。

采用對照品進行。

線性范圍一定要將回收率試驗的高濃度包含進去，否則回收率濃度過線性范圍，缺乏定量依據，這個錯誤常見。

精密度

同一份供試品（樣品）溶液，連續進6次。

計算峰面積RSD<2%，資料中體現7張圖（1張空白，6張樣品液）。

進資料的圖譜必須采用生產線驗證的第1批樣品進行。

溶液穩定性

與精密度在同一天穿插進行，實驗前進行良好的排序設置，能共用的圖盡量共用減少工作量。以下時間點必做（除非已知穩定情況可減少時間點）。

0、4、6、8、10、12、18、24。

實驗過程中可取精密度中的圖作為2h或4h，甚至6h。

做7至8個時間點，在撰寫申報資料時后以6個數據填報。

溶液穩定性數據至少做到16h穩定（盡量做得更長時間，都是自動進樣，一個過夜就至少在12小時以上，時間太短無法證明溶液穩定性），特殊情況下可以采用低溫進樣器或特殊的保存方法或現配現分析等操作，但要求有數據作為支持依據，方可將特殊處理方法定入標準。

6個數據計算峰面積RSD<2%。

重復性

同一批號樣品，同一人員同法操作分別稱取2份對照品及6份供試品（樣品）溶液，各進1次。

計算含量RSD<2%，資料中體現9張圖（1張空白，2張對照，6張樣品）。

進資料的圖譜必須采用生產線驗證的第1批樣品進行。

中間精密度

同一批號樣品，不同人員，不同設備，同法操作，分別稱取2份對照品及6份供試品（樣品）溶液，各進1次。次日操作，避免產生壓針的疑問（萬一審評老師沒有注意到設備編號，所以別自找麻煩，次日操作）。對照品也要重新稱取。

與重復性的6個數據，共同參與統計，計算12個含量數據結果，RSD<2%，資料中體現18張圖，其中重復性9張，次日數據9張（1張空白，2張對照，6張樣品）。進資料的圖譜必須采用生產線驗證的第1批樣品進行。

度

采用回收率試驗方式進行，通常采用直接回收率實驗法，按照80%、、120%比例分別稱取樣品，同法操作，每個比例各3份樣品，各進1次。

以中間精密度的含量均值作為理論含量，計算回收率，回收率變動范圍98%—102%，回收率RSD<2%，資料中體現12張圖（1張空白，2張對照，9張樣品）。進資料的圖譜必須采用生產線驗證的第1批樣品進行。

原料藥采用直接回收率。

制劑采用加樣回收率測定：

采用20片或粒制劑單位終產品混合研碎后，按比例稱取進行加樣回收，加樣回收率采用80%、、120%比例，1:1加入，加樣回收率不能達標時（輔料有吸附或干擾較大時），方可采用直接回收率。回收率變動范圍98%—102%，回收率RSD<2%，資料中體現12張圖（1張空白，2張對照，9張樣品）。

耐用性實驗

改變色譜柱

不同的色譜柱，共3個。比較分離度，保留時間，含量測定結果。

如果不足3個可采用多個批號或不同多個批號的方式，不能采用廢柱子進行實驗。

好在同一天對倆份樣品溶液和倆份對照溶液進行。

3個的色譜柱共15張圖（每個色譜柱1張空白，2張對照，2個樣品各1張），各條件下的含量數據（n=6）的RSD<2%。進資料的圖譜必須采用生產線驗證的第1批樣品進行。

流動相比例

流動相的低組分比例變化約±5%。

好在同一天對倆份樣品溶液和倆份對照溶液進行。

3個不同比例的流動相15張圖（每個比例1張空白，2張對照，2個樣品各1張），各條件下的含量數據（n=6）的RSD<2%。進資料的圖譜必須采用生產線驗證的第1批樣品進行。優標準條件的圖譜每天都要重做，為了避免色譜柱效能下降或引起其他問題無法確認。

流速變化

流速±10%。

好在同一天對倆份樣品溶液和倆份對照溶液進行。

3個不同流速的流動相15張圖（每個比例1張空白，2張對照，2個樣品各1張），各條件下的含量數據（n=6）的RSD<2%。進資料的圖譜必須采用生產線驗證的第1批樣品進行。優標準條件的圖譜每天都要重做，為了避免色譜柱效能下降或引起其他問題無法確認。

不同pH

pH值±0.2

好在同一天對倆份樣品溶液和兩份對照溶液進行。

3個不同pH的流動相15張圖（每個比例1張空白，2張對照，2個樣品各1張），各條件下的含量數據（n=6）的RSD<2%。進資料的圖譜必須采用生產線驗證的第1批樣品進行。優標準條件的圖譜每天都要重做，為了避免色譜柱效能下降或引起其他問題無法確認。

柱溫

柱溫±5℃

25℃、30℃（或優參數）、35℃

好在同一天對倆份樣品溶液和一份對照溶液進行。

3個不同溫度15張圖（每個比例1張空白，2張對照，2個樣品各1張），各條件下的含量數據（n=6）的RSD<2%。進資料的圖譜必須采用生產線驗證的第1批樣品進行。優標準條件的圖譜每天都要重做，為了避免色譜柱效能下降或引起其他問題無法確認。

0天樣品檢測

方法學結束且各項考察數據符合要求后，對3批生產線驗證樣品及被仿品在同一天進行檢測。此數據在申報資料產品單中體現，且可作為穩定性的0天數據。

雙樣雙針。對照品也為雙樣雙針。